No Image

Пцр лаборатория это

СОДЕРЖАНИЕ
5 просмотров
17 ноября 2019

Высокотехнологичные лабораторные методы диагностики дают возможность выявить множество заболеваний на самых ранних стадиях. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) — один из самых новых и точных способов диагностики. За его разработку ученый Кэри Муллис получил в 1993 году Нобелевскую премию. Сегодня этот метод хотя и считается экспериментальным, но уже широко и успешно применяется в медицине.

ПЦР-диагностика: суть подхода

Метод ПЦР использует принципы молекулярной биологии. Его суть заключается в применении особых ферментов, которые многократно копируют фрагменты РНК и ДНК возбудителей болезни, которые находятся в пробах биоматериала, например в крови.

После этого работники лаборатории сверяют полученные фрагменты с базой данных, выявляют тип возбудителя болезни и его концентрацию.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, охлаждающем и нагревающем пробирки с пробами биоматериала. Нагрев и охлаждение необходимы для проведения репликации. Точность температурного режима влияет на точность результата.

Сферы применения метода

Диагностические возможности метода ПЦР огромны, с его помощью можно выявить самые разные инфекции. Чаще всего ПЦР-метод применяют для диагностики:

  • ВИЧ;
  • герпеса;
  • различных половых инфекций, в частности хламидиоза, уреаплазмоза, гарднереллеза, микоплазмоза и трихомониаза;
  • кандидоза;
  • гепатитов;
  • мононуклеоза;
  • листериоза;
  • цитомегаловируса;
  • туберкулеза;
  • вируса папилломы человека;
  • клещевого энцефалита.

Это далеко не полный список, метод ПЦР-анализа используется в разных областях медицины.

Преимущества и недостатки подхода

У диагностики методом ПЦР много плюсов:

Высокая чувствительность. Метод позволяет выявить возбудителя болезни даже при наличии нескольких молекул его ДНК, то есть на очень ранних стадиях, при хронической форме заболевания, а так же в случаях, когда болезнь никак себя не проявляет, протекая латентно.

Универсальность. Для проведения ПЦР анализа подходит почти любой биоматериал — от крови и слюны до клеток кожи.

Широкий охват. Исследование одного образца может выявить сразу нескольких возбудителей болезни.

Оперативность. Результат, как правило, готов через 5–7 часов, то есть получить заключение можно уже на следующий день после забора биоматериала.

Точность. Метод ПЦР практически никогда не дает ложноположительных или ложноотрицательных результатов, если была соблюдена технология проведения этого анализа.

Невысокая стоимость. По цене ПЦР-анализ сравним с любыми другими лабораторными анализами крови.

Однако следует понимать, что совершенных методов анализа не бывает. У ПЦР есть и минус — высокие требования к соблюдению технологии и к профессионализму лаборантов. Если образец был загрязнен, анализ может дать ложный результат. Поэтому проводить ПЦР-диагностику лучше только в самых лучших лабораториях, где внедрены системы контроля качества работы.

Исследуемый биоматериал

Для ПЦР-диагностики заболеваний на анализ берут разные виды биоматериала. Выбор зависит от типа инфекции. При анализе на ЗППП методом ПЦР берут соскоб или мазок из шейки матки или уретры, а также мочу. Для выявления герпеса, цитомегаловируса, гепатита, токсоплазмоза и ВИЧ на анализ берут кровь. При анализе на мононуклеоз и цитомегаловирус берут мазок из зева. Спинномозговая жидкость используется для анализа при поражениях нервной системы, для диагностики внутриутробных инфекций исследуются ткани плаценты, для выявления легочных инфекций — мокрота или плевральная жидкость.

Подготовка к исследованию

Подготовка к ПЦР-диагностике напрямую зависит от типа биоматериала. Кровь сдается натощак утром. Моча также сдается утром, в лабораторных условиях, в стерильный контейнер. Перед сдачей мазка или соскоба из урогенитальной области нельзя вступать в половые контакты за несколько дней до исследования, не следует проводить спринцевания. Мазок или соскоб нельзя сдавать во время менструации и в течение 2-х дней после ее окончания.

Читайте также:  Наросты под ногтями на ногах

Методы ПЦР-диагностики заболеваний

Существует немало различных методик ПЦР-диагностики: ПЦР в реальном времени, секвенирование, пиросеквенирование, микрофлюидные технологии. Сейчас наиболее распространенным способом проведения анализа является ПЦР в реальном времени — этот метод практически не допускает ложноположительных результатов, к тому же срок обработки образцов при исследовании таким способом сокращается — результат можно получить уже через час.

Расшифровка результатов

Для пациента результат ПЦР-анализа может быть либо положительным, либо отрицательным. Отрицательный означает, что следов враждебной ДНК не обнаружено и человек здоров. Положительный подразумевает наличие фрагментов ДНК возбудителя болезни — это значит, что человек заражен и ему требуется лечение.

Нередко ПЦР-диагностика дает положительный результат, но пациент не чувствует никакого недомогания, а признаки болезни отсутствуют. Однако это означает не ошибку, а очень раннюю стадию заболевания. В этом случае необходимы дополнительные исследования и лечение. Если заболевание было диагностировано на столь ранней стадии, следует начинать терапию как можно скорее, ведь чем дальше зайдет болезнь, тем сложнее будет ее вылечить.

ПЦР-диагностика инфекций невероятно точна — она позволяет обнаружить возбудителя болезни, даже если в пробе находится всего одна-единственная молекула его ДНК. Именно это качество сделало ПЦР-анализ одним из эффективнейших диагностических инструментов как для определения наличия инфекции, так и для контроля за ходом лечения.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) — это один из методов молекулярно-биологической, или ДНК-диагностики. Его суть заключается в обнаружении инфекционного возбудителя в биологическом образце генетического материала (ДНК или РНК).

Исследования проводятся на базе клинико-диагностической лаборатории. Её оборудуют, согласно требованиям, которые предъявляются к данному типу лабораторий.

Например, стандарты оснащения лаборатории, которая работает на базе кожно-венерологического диспансера, утверждены в Приказе Министерства здравоохранения РФ от 15 ноября 20102 г. №924 (приложение №16 к «Порядку оказания медицинской помощи по профилю «дерматовенерология»).

Исследования в ПЦР лаборатории

В лаборатории проводится широкий спектр исследований. С помощью полимеразной цепной реакции можно выявить вирусные гепатиты B, C, D, G; урогенитальные инфекции; инфекции, которые передаются половым путем (ИППП), папиломмавирусные, TORCH и герпесвирусные инфекции; оппортунистические, гнойно-септические, внутриутробные, кишечные и нейроинфекции; инфекции дыхательного тракта.

ПЦР-диагностика очень эффективна, поскольку позволяет выявить возбудителя инфекции и диагностировать заболевание ещё до его клинических проявлений. При этом исключаются ложные результаты.

Требования к помещению

В лаборатории выделяют рабочие зоны, которые соответствуют этапам ПЦР-анализа:

  • Для приёма, регистрации, разбора и первичной обработки биоматериала. Здесь принимают, сортируют, маркируют и хранят материал.
  • Для выделения ДНК/РНК. Оптимально размещать зону в отдельном помещении, но допускается и размещение в помещениях, где проводят другие исследования (кроме генно-инженерных!). В последнем случае необходимо оборудовать ПЦР-бокс или бокс биологической безопасности, в котором запрещено проводить любые другие методы исследований, кроме ПЦР. Под зону выделяют помещение площадью 15–20 кв. м.
  • Для приготовления реакционных смесей и проведения исследований. Здесь готовят ПЦР-смеси, вносят выделенные препараты ДНК/РНК в пробирку для ПЦР. Оптимальная площадь помещения 15–20 кв. м.
    Этапы выделения ДНК/РНК и приготовления смесей проводят в разных помещениях. Однако допускается совместить их. В таком случае обязательно оборудуют боксы – отдельный для каждого этапа.
  • Для детекции продуктов амплификации. Оптимально размещать зону в отдельном помещении, в котором имеется ПЦР-бокс. Обычно при детекции используют метод электрофореза и гибридизационного анализа. Если необходимо использовать оба метода одновременно, необходимо выделить отдельную зону для проведения гибридизационного анализа. При этом расходные материалы и посуду для каждого метода используют свою. Оптимальная площадь помещения для детекции составляет 25–30 кв. м.
Читайте также:  Самые прочные презервативы

Если в лаборатории применяют метод real-time PCR, то не нужно выделять зону детекции.

Кроме рабочих зон, необходимо выделить и вспомогательные помещения: архива (для хранения документации), комнаты для персонала (отдыха, приёма пищи), раздевалки, кабинета заведующего, склада, санузла.

При возможности рекомендовано выделить отдельное помещение под автоклавную для обеззараживания исследуемого материала. Если такой возможности нет, то при соблюдении правил биологической безопасности допускается общая с другими подразделениями лаборатории автоклавная.

Кроме обязательного зонирования, к помещению ПЦР-лаборатории предъявляются такие технические требования: наличие водопровода, канализации, электричества, отопления, освещения (естественного и искусственного), приточно-вытяжной или вытяжной вентиляции, систем кондиционирования и пожаротушения.

Не допускается воздухообмен между зоной детекции и остальными зонами.

Внутренняя отделка

Стены, потолок и пол должны иметь гладкую поверхность без щелей, стыков, трещин, а пол – покрыт антискользящим материалом. Они должны быть устойчивыми к воздействию дезинфицирующих и моющих средств, легко обрабатываться.

Согласно «Методическим указаниям по применению бактерицидных ламп для обеззараживания воздуха и поверхности в помещениях», во всех рабочих зонах ПЦР-лаборатории устанавливают бактерицидные лампы из расчёта 2,5 Вт/куб. м.

Оборудование и мебель

Согласно Стандарту оснащения молекулярно-биологического подразделения клинико-диагностической лаборатории, необходимо такое оборудование: термостат твердотельный для пробирок типа Эппендорф, аплификатор, насос с колбой-ловушкой, микроцентрифуга для пробирок, центрифуга-встряхиватель (вортекс), настольный бокс для ПЦР, трансиллюминатор, аппарат для проведения горизонтального электрофореза с источником питания, Прибор для чтения результатов исследования на биомикрочипах (ДНК-чипах), камера для гибридизации (для проведения исследований на биомикрочипах), комплект оборудования для проведения исследований методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, наборы одно- и восьмиканальных пипеточных дозаторов, холодильники (бытовой и низкотемпературный от –70 до –80 °С).

Также ПЦР-лабораторию нужно оснастить: системой гель-электрофореза (для отображения результатов) и гель-документации (для их анализа).

В ПЦР-лаборатории устанавливают медицинскую мебель — рабочие столы, стулья, тумбочки, полки и шкафы (для хранения посуды, материалов и т. д., а также документации).

Главные требования к медицинской лабораторной мебели — эргономичный дизайн, удобство, долговечность, устойчивость к воздействию химических и других веществ.

Специфика ПЦР-лабораторий

Компания ЗАО «Лабораторная Диагностика» специализируется на комплексном оснащении ПЦР-лабораторий в России с 1997 года. Мы обладаем уникальным многолетним опытом создания лабораторий ПЦР «под ключ». Наши специалисты готовы ответить на любые ваши вопросы по ПЦР-диагностике, оборудованию, реагентам, расходным материалам, требованиям и нормам организации современных ПЦР лабораторий.

Организация ПЦР-лаборатории требует тщательной подготовительной работы. Необходимо заранее определить, какие именно задачи предстоит решать в лаборатории. Помимо этого важно понимать, какими методами будут достигнуты поставленные задачи.

Области использования различных методов ПЦР

Тип лабораторииПЦР с электрофоретической детекциейПЦР в реальном времениПЦР в модификации FLASHСеквенирование по СэнгеруПиросеквенированиеМультиплексный анализ
Клинико-диагностическая++++
Судебная медицина+++
Научно-исследовательская++++++
Мобильная лаборатория+
Анализ ГМО++
HLA-лаборатория+++
Рекомендуемый объем исследований в день20 — 20020 -20020 — 2008 — 32*4-8*96 — 288
Диапазон стоимости решения900 000 — 4 000 000 руб1 000 000 — 5 000 000 руб1 000 000 — 4 000 000 руб2 000 000 — 13 000 000 руб5 000 000 — 35 000 000 руб2 000 000 — 15 000 000 руб
Читайте также:  Второй период родов называется

* — условное значение, т.к. анализ занимает более одного дня.

В основу функционирования ПЦР-лаборатории могут быть заложены три основных метода:

  • Классическая полимеразная цепная реакция (ПЦР с электрофоретической детекцией).
  • ПЦР в режиме «реального времени» (Real-time PCR).
  • ПЦР с флуоресцентной детекцией по «конечной точке» (FLASH).
МетодТип оборудованияПримеры приборов
Классическая ПЦРАмплификатор (thermal cycler)TProfessional (Biometra)
ПЦР в реальном времениАмплификатор для детекции в режиме «реального времени» (real-time PCR machine)
ПЦР с детекцией по «конечной точке»

Флуоресцентный ПЦР-детектор ( FLASH — detector )

Мультиканальный флуориметр ALA-1/4 (BioSan)

Стоит заметить, что в ПЦР-лаборатории, при соответствующем оснащении, можно использовать и другие методы:

  • секвенирование по Сэнгеру;
  • высокопроизводительное секвенирование (пиросеквенирование);
  • гибридизационные микрочипы высокой плотности;
  • микрофлуидальные чипы;
  • мультиплексный анализ.

Выбор метода повлияет на общую стоимость проекта оснащения лаборатории. Помимо типа ПЦР-лаборатории, не менее важно определить приблизительный пробопоток вашей будущей лаборатории. Какое количество анализов/тестов/реакций вы планируете выполнять в день/неделю/месяц в лаборатории? Исходя из ожидаемого количества, можно заранее определить количество сотрудников/операторов, которые будут проводить реакции в лаборатории.

Параллельно с выбором оборудования следует совершить не менее важный шаг – осмотреть помещение, где планируется организовать лабораторию. Подробную информацию вы можете найти в разделе "Требования к организации помещений для лаборатории ПЦР". Здесь же сообщим некоторые принципиальные моменты:

  • во-первых, рабочих зон должно быть не менее двух;
  • во-вторых, обязательны приточно-вытяжная вентиляция, водоснабжение, электрообеспечение помещений, системы пожаротушения;
  • в-третьих, зона детекции продуктов амплификации методом электрофореза должна быть максимально удалена от зон выделения ДНК/РНК и приготовления смеси реакции;
  • в-четвертых, размер помещений зависит от количества сотрудников в лаборатории, но рекомендации могут быть следующие: площадь зоны выделения нуклеиновых кислот = 15-20 кв.м., площадь зоны приготовления реакционное смеси = 15-20 кв.м., площадь зоны детекции = 25-30 кв.м;
  • в-пятых, лабораторная мебель должна обеспечивать удобство работы (столы по периметру помещения, шкафы, полки, тумбочки, стулья).

Частные методические и организационные вопросы

  1. Каким способом выделять нуклеиновые кислоты?

В данном разделе обсуждаем принципиальный вопрос: как вы будете выделять нуклеиновые кислоты из образцов? Варианта два – ручным методом с помощью готовых наборов, либо с помощью автоматических экстракторов.

Ручной метод дешевле. В этом главное преимущество. Недостатков несколько: более длительная процедура, меньшее количество образцов можно выделить за день, колебания в качестве и количестве выделяемой ДНК/РНК, зависимость от оператора. Автомат позволяет высвободить рабочие руки оператора для другой работы, стандартизирует качество и количество выделения НК, сокращает время выделения, увеличивает количество выделяемых образцов за рабочий день/смену. Главный недостаток: более высокая стоимость выделения одного образца.

Как правило, на начальном этапе существования лаборатории выделяют ручным методом. При увеличении пробопотока в ПЦР-лаборатории начинают использовать экстрактор нуклеиновых кислот.

  1. Как обеззараживать образцы и пробирки ПЦР?

Многие ПЦР-лаборатории имеют дело с образцами, которые необходимо проанализировать на наличие ДНК/РНК возбудителя инфекционных заболеваний. Существуют разные требования безопасности при работе с патогенами III-IV группы и с микроорганизмами I-II групп патогенности. Для подробного знакомства с данным вопросом рекомендуется изучить раздел "Нормативно-правовые документы".

Все отходы, возникающие в процессе ПЦР, подвергаются обязательному химическому (гиппохлорид) и термическому (стерилизация) обеззараживанию.

Комментировать
5 просмотров
Комментариев нет, будьте первым кто его оставит

Это интересно
No Image Венерология
0 комментариев
No Image Венерология
0 комментариев
No Image Венерология
0 комментариев
No Image Венерология
0 комментариев
Adblock detector